“寺田屋事件”。此事件造成公武合派和尊王攘夷派的完全分裂，并加速了公武合运动的程。朝廷颁布敕命。基本满足了岛津久光的要求并宣布要改革幕政。1864年初，作为公武合运动结晶的雄藩会议筹备就绪，设置了德川庆喜、岛津久光等六人组成的“参与会议”，在天皇主持讨论国策。然而，因各雄藩各怀私心，政见不同，德川庆喜则梦想幕府重新独揽大权，不到三个月，“参与会议”便因六参议的相继辞职而烟消云散。公武合运动遭受重大挫折。

而尊王攘夷运动在一度沉寂之后。重新涨起来。1865年初，另一雄藩州的藩政权回到尊王攘夷派木孝允、杉晋作等人手中，州开始实行倒幕割据政策。幕府策划第二次征讨州。本来萨曾在禁门之变、第一次征讨州的战争中多次与州兵戎相见，这时却因州通过萨购买英国武而逐渐与之接近。大久保利通早年即有“一国割据”思想，此时看到它以另一形式在州实现。便逐渐转变为倒幕派。1866年2月，萨两藩在坂本龙、中冈慎太郎的斡旋，结成了倒幕同盟，萨藩与德川庆喜的友好关系从此中断。为确保倒幕成功，大久保利通与朝廷公卿岩仓视合作，利用天皇权威，于1868年1月3日成功发动廷政变。朝廷发布的“王政复古大号令”。废除了朝廷的摄政、关白制度与幕府的征夷大将军。随后朝廷的军队击败至京都郊外的幕府军队，在此后的戊辰战争中消灭了幕府。大久保利通则担任参谋后又任总裁局顾问理务，协助西乡指挥作战，从而建立并巩固了明治新政权。

以天皇为首的朝廷在倒幕过程中的微妙作用。给大久保利通以很的印象。他断定，为了领导日该国，天皇必须首先“一新”朝廷之旧弊，为此就必须使天皇与象征旧弊的京都割断联系。创造适应新时代的天皇格。明治政府成立后的迁都、改元等都反映了他这思想。

明治政府在彻底消灭幕府势力后，大久保利通先担任新政府的参议。又于1871年6月任大藏卿。1871年4月，岩仓视使团访欧，大久保利通亦随行。在巡访中，普鲁士的“铁血宰相”俾斯麦给大久保利通以最印象，他认为日本想富只有象俾斯麦一般行事。

正当大久保利通在欧访问的时候，国以西乡隆盛为首的留守政府主张侵略朝鲜，以转移士族对政府的不满。大久保利通得到这个消息立即回国，对于“征韩”问题，大久保利通绝不是一个和平主义者。他只是到日本尚不备外征的条件，当务之急是抓学习西方,大力推行“产兴业”政策，加速日本资本主义工业化的步伐。于是大久保利通和岩仓视结合起来，施展政治手腕，击败以西乡隆盛为首的征韩派，把他们赶中央。这场政治斗争，史称“明治六年十月政变”。从此以后，以三条实为太政大臣、岩仓视为右大臣、大久保利通为务卿的政治制成立了。

1873年11月10日务省正式成立，大久保利通以参议兼任务省务卿。他把劝业、警保、籍、驿递（即邮政）、土木、地理六个门和测量司的大权都集中到自己手里。大久保利通所辖的范围涉及到“产兴业”的各个方面。他在担任务卿期间，创建了明治政府的行政组织，即包括外务、务、大藏、陆军、海军、文、教、工、司法、十个省的中央官僚机构。于是以大久保利通领导的务省为中心，同大隈重信控制的大藏省、伊藤博文的工省在日本形成了推行产兴业政策的三位一的领导制。

大久保利通执掌大权时，走上了统治的路。他毫不留地镇压所有的反抗活动。对版籍奉还、废藩置县一直心怀不满的岛津久光上书天皇，提14条建议，反对各项资产阶级改革，并要求撤掉大久保利通的职务。当然大久保利通等改革派不能接受，对保守派行反击，岛津久光被迫引退。当岛津等旧藩势力在行活动的时候，对明治维新各项资产阶级改革烈不满的反动士族公开发动了的武装叛。最先发动的是1874年2月由江藤新平和岛义勇领导的“佐贺之”。结果被大久保利通严厉的镇压了去。

大久保利通有着和俾斯麦差不多的冷血格和铁腕手段，因政见不同他可以将早年的政治伙伴有新七置于死地。而当岛津久光这个大恩人不能跟上时代时，也被他一脚踢开。明治天皇虽然赞赏他的才能，却并不喜他，因而也谈不上对他的绝对信任了。